氢气水在治疗小鼠结肠炎可与磺胺吡啶相媲美【全文】

氢气水在治疗小鼠结肠炎可与磺胺吡啶相媲美

摘要

结肠炎是一种肠道炎症,伴有腹痛、腹泻、疲劳和发烧。其病因是多因素的,但与过度生产的炎症和氧化介质有关。目前还没有治愈这种疾病的方法,用于治疗这种疾病的药物经常会产生有害的副作用。氢气被认为具有抗炎和抗氧化作用,这可能使其成为一种新的治疗结肠炎的药物。我们通过在饮用水中给予右旋糖酐硫酸钠(DSS)7天诱导小鼠急性结肠炎模型。将小鼠分为5(n=6);正常,结肠炎,氢气治疗的结肠炎,磺胺吡啶治疗的结肠炎,氢气+磺胺吡啶治疗的结肠炎。从第3天到第10天,小鼠被给予氢气,磺胺吡啶,或两者都给予。生氢气片溶于水中,制富氢气(氢气水)给药,自由服食,灌胃200μL。评估疾病活动指数(DAI)、组织学变化、炎症和氧化应激标志物。与对照组相比,氢气水和柳氮磺胺吡啶显著改善体重、DAI、粘膜损伤、隐窝缺失和脾脏重量。两种处理均显著降低炎症(高敏c反应蛋白)和恢复氧化还原平衡(总硫醇、超氧化物歧化酶、过氧化氢气酶活性)。有趋势表明联合治疗比氢气水或柳氮磺胺吡啶单独治疗更有效。此外,氢气水往往与柳氮磺胺吡啶一样有效,而且往往比柳氮磺胺吡啶更有效。氢气水可能对DSS诱导的小鼠结肠炎有治疗作用。

介绍

特发性炎症性肠病与进行性残疾高发病率相关。结肠炎是炎症性肠病的主要形式之一,目前还没有有效的治疗或治愈(Piovani2019)。仅在美国,相关年成本就高达近150亿美元(Gajendran2019)。结肠炎的推定病因是多因素的,涉及遗传、自身免疫、微生物组和各种环境因素。这导致炎症和活性氧的过度产生,两者都进一步诱发和加剧结肠炎(Gajendran2019)

氢气最近被认为是一种具有抗炎、抗氧化和信号调节作用的新型药物(LeBaron2019)氢气是一种稳定的双原子气体,可通过吸入或摄入含有溶解的富氢气水来给药(LeBaron2019)。临床研究表明,氢气在许多不同领域都有益处,包括运动医学(LeBaron2019)、认知障碍(Nishimaki2018)、中风(Ono2017])、癌症(AkagiBaba2019)、代谢综合征(LeBaron2020)以及最近的COVID-19患者(Guan2020;Russell2020)

此前,在炎症性肠病动物模型中对氢气水进行了研究,并取得了良好的效果(Kajiya2009)。然而尚不清楚氢气水与磺胺吡啶等标准药物治疗的效果如何。此外,我们使用饮用氢气水和口服灌胃代替富含氢气的盐水,并使用更高浓度的氢气水。因此,我们建立了右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的急性结肠炎模型,比较了氢气水与磺胺吡啶的抗氧化和抗炎作用。

材料和方法

药物和化学物质

高浓度氢气水是通过产氢气片剂制成的(氢气水天然保健产品公司,加拿大BC)。对于饮用,氢气水12小时准备两次,将一片药片溶解在一个密封的500毫升苏打瓶中,用氧化还原滴定法测定浓度。右旋糖酐硫酸钠(DSS40kD)、苏木精和伊红(H&E)、丙二醛(MDA)、总硫醇、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢气酶材料均购自Sigma

 

道德声明

30C57BL/6雄性小鼠(6-8周龄)由伊朗巴斯德研究所(德黑兰,伊朗)提供,并按照马什哈德医科大学《机构动物护理指南》的标准议定书进行饲养。小鼠接受自由饮水和食物,并被保存在实验室温度为(22-25°C)的空调房间,12小时的光/暗循环。

 

小鼠结肠炎模型及实验方案

如表1所示。将小鼠随机分为5(每组n=6):i)对照组,饮用全10天的饮用水;ii)结肠炎组,饮用1%DSS7(3.3mL/小鼠/),然后饮用正常饮用水3;iii)磺胺吡啶治疗组,收到1%饮用水中的DSS1-7,3-10100毫克/公斤/天柳氮磺胺吡啶通过口服法,()氢气水收到DSS1%的饮用水从1-7,”和氢气水3-10天喝酒和200μL(>1.5mM)通过日常口服,5)联合治疗组,第3~7天口服1%(w/v)DSS,第3~10天口服100mg/kg/d磺胺吡啶和氢气水灌胃(200μL)

 

结肠炎的评估

在研究过程中,每天报告体重变化,粪便特征,直肠出血和直肠脱垂。疾病活动指数(DAI)数据作为平均体重变化评分、粪便一致性、直肠出血和脱垂如前所述(见表2)(Cooper1993

结肠的组织病理学评价

在实验结束时,老鼠被安乐死,结肠被切除,清洗,并测量其重量和长度。将福尔马林固定的结肠组织进行清洗、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(H&E)Masson染色,光镜检查,并按照表3的标准组织病理学标准进行分级。

组织准备以测量氧化应激标记物

结肠组织称重,用PBS冰匀浆。然后,在4°C,10000rpm离心20分钟。收集上清液并在-70℃保存,以评估氧化/抗氧化标志物,包括丙二醛(MDA)、总硫醇、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢气酶活性(Chassaing2014)

MDA测定

丙二醛(MDA)的测定方法是将1ml10%的匀浆与2ml含有硫代巴比妥酸、三氯乙酸和盐酸的溶液在沸水中混合45分钟,并离心10分钟。在535nm处读取吸光度,按公式C(M)=(A/1.65=105)计算MDA水平。

总硫醇组测定

用二硫代硝基苯甲酸(DTNB)试剂计算总硫醇浓度。结肠匀浆中加入1mLTris-EDTA缓冲液(pH=8.6)。测试吸光度在412nm处阅读Tris-EDTA缓冲液(A1)。将该溶液加于20μLDTNB试剂中,室温保存15分钟。然后再次报告样品吸光度(A2)DTNB试剂的吸光度单独作为空白(B)。硫醇总浓度(mM)的测定方法如下:(mM)=(A2−A1−B)×(1.07/0.05×13.6)

SOD活性测定

MadeshBalasurbamanian(1997)描述的比色法测定SOD活性。该方法是通过邻苯三酚自氧化合成超氧化物歧化酶,并抑制超氧化物依赖的3-(4,5-二甲基噻唑-2-)2,5-二苯基溴化四唑(MTT)还原为其甲酰胺。反应结束时加入二甲基亚砜(DMSO),使颜色稳定。简而言之,将均质结肠倒入孔中,在室温下孵育5分钟。用DMSO终止反应,然后用酶标仪在570~630nm之间读取参考波长。SOD的一个单位被称为抑制MTT降低50%所需的蛋白质量(MadeshBalasubramanian,1997)

CAT活性测定

过氧化氢气酶活性的测定是通过测定过氧化氢气水解速率在240nm的磷酸钠缓冲液。酶反应速度可以通过在正常条件下1分钟内将过氧化氢气转化为氧气来确定(MadeshBalasubramanian,1997])

测定hsCRP

炎症标志物、高敏c反应蛋白(hsCRP)的测定采用乳胶增强浊度免疫分析法。抗CRP抗体的凝集是检测吸光度变化(500nm)。变化的幅度与样品中CRP的量成正比,浓度由所制备的标准校准曲线插值。

统计分析

结果以平均值±平均值的标准误差表示,并通过学生t检验或方差分析Tukey的多重比较检验进行分析。软件分析使用SPSSv.20统计软件进行。

结果

氢气水改善结肠炎的临床症状

每日监测动物体重。在实验过程中,正常对照组小鼠体重持续增加,而DSS组小鼠体重下降。相反,氢气组、磺胺吡啶组和联合用药组小鼠体重在治疗后明显改善(1A)。与对照组相比,经DSS处理的小鼠DAI评分显著升高(P<0.001)。然而,与结肠炎组相比,磺胺吡啶、氢气和联合用药组的DAI评分均显著降低(P<0.001)(1C)

 

氢气改善结肠炎模型的结肠组织损伤

在结肠炎小鼠中,柳氮磺胺吡啶(P<0.01)和柳氮磺胺吡啶加氢气(P<0.001)显著抑制DSS诱导的结肠缩短(2A,B结肠炎导致结肠萎缩变短)。硫柳氮嗪加或不加氢气均可减轻DSS诱导的结肠重量下降(P<0.05)氢气治疗有降低结肠重量/长度比的非统计学趋势,提示炎症和组织水肿的减少。

组织病理学评价

比较了结肠组织的组织学损伤(3A)盐酸磺胺吡啶对大鼠结肠炎模型和对照小鼠的影响。

DSS给药导致粘膜炎症和细胞浸润等病理改变(3B),上皮细胞层破坏(3C和隐窝缺失(3D)导致组织学评分显著升高(3E)。一方面,氢气和磺胺吡啶,特别是联合使用,与结肠炎小鼠相比,显著降低了这些组织学畸变(3B-E)。与结肠炎组相比,氢气在预防粘膜损伤方面略优于磺胺吡啶(P<0.001)。此外,脾重和脾重/体重比增加了,这通常与炎症的程度有关。在DSS诱导的结肠炎小鼠中,氢气联合或不联合使用磺胺吡啶均能改善这些表现(P<0.001;3f,G)

 

氢气磺胺吡啶可改善DSS诱导的结肠炎

DSS诱导的结肠炎中,单独氢气治疗或联合磺胺吡啶治疗对高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平的影响也被评估。

如图4所示。DSS治疗组hsCRP水平均显著高于对照组。然而,与结肠炎组相比,氢气(P<0.01)、磺胺吡啶(P<0.05)和联合(P<0.001)hsCRP显著降低。

 

 

氢气磺胺吡啶可以减少结肠炎的结肠纤维化

通过Masson染色可见,结肠炎组结肠炎小鼠的胶原结肠组织纤维化程度更高(见图5)

氢气和磺胺吡啶可显著降低DSS诱导的结肠胶原沉积(P<0.001)与柳氮磺胺吡啶相比,氢气组效果更显著(P<0.05),其中氢气组效果最大(P<0.001)(5A,B)

 

 

 

氢气磺胺吡啶可改善DSS诱导的结肠炎的氧化还原状态

与对照组相比,DSS显著增加了氧化应激,降低了抗氧化状态。然而,氢气和磺胺吡啶单独或联合使用对DSS诱导的结肠炎具有保护作用,如图6所示。

虽然与结肠炎模型相比,柳氮磺胺吡啶显著降低MDA水平(P<0.001),但与柳氮磺胺吡啶治疗相比,氢气治疗效果显著(P<0.001),并从根本上阻止了DSS诱导的MDA增加。同样,尽管与结肠炎相比,所有处理均显著提高了超氧化物歧化酶(SOD)、总硫醇和过氧化氢气(CAT)水平(P<0.001),但添加和不添加磺胺吡啶的氢气显著更有效(P<0.001)。此外,添加和不添加磺胺吡啶的氢气基本上阻止了DSS诱导的这些抗氧化水平的下降。在提高过氧化氢气酶活性水平方面,联合处理总体上有更有效的趋势,但仅在统计学上高于氢气处理(氢气和磺胺吡啶分别为P<0.01vs.P<0.001)

 

 

讨论

在本研究中,如前所述,我们在饮用水中使用1%DSS诱导急性小鼠结肠炎模型(Binabaj2019)。与之前的数据一致,我们发现DSS导致结肠炎症状,而氢气水和或磺胺吡啶治疗具有保护作用。从表型角度看,氢气在改善体重、降低疾病活动指数、维持结肠长度和体重方面与磺胺吡啶同样有效,甚至比磺胺吡啶更有效。此外,在炎症、粘膜损伤、隐窝缺失、脾脏重量以及病理性结肠纤维化的组织病理学评估中也观察到这种比较优越。不过氢气与柳氮磺胺吡啶联合治疗往往比单独使用更有效。

 

中国学者用醋酸诱导的大鼠结肠炎模型中也观察到类似益处,该模型每隔一天给予富含氢气的生理盐水1次,持续2周。他们报告体重减轻,腹泻减少,粘膜损伤减少(He2013)。在另一份报告中,DSS被用于诱发肠易激综合征,氢气治疗也显著减轻了该综合征(Shen2017)

 

氢气已在动物和人类研究中被证明具有抗炎和抗氧化作用(LeBaron2019)DSS诱导过度炎症并消耗内源性抗氧化剂导致氧化应激(Kajiya2009])本研究结果表明,氢气可以减轻炎症,这可以通过降低DSS诱导的高敏c反应蛋白的增加来体现。在这种情况下,氢气水似乎比柳氮磺胺吡啶有效,但不如联合用药有效。同样,氢气水可以防止DSS诱导的脂质过氧化标记物丙二醛的增加。正如我们在本研究中观察到的,这可能是由于氢气能够防止DSS诱导的抗氧化剂、超氧化物歧化酶和过氧化氢气酶以及总硫醇浓度的下降。

 

氢气的这些抗氧化作用与之前研究一致,包括对人类的研究。例如,代谢综合征受试者(n=60)摄入高浓度氢气6个月,除了改善代谢和临床参数外,还导致炎症标志物降低和抗氧化状态改善(LeBaron2020)氢气发挥抗氧化作用的机制之一是通过诱导Nrf2/Keap1抗氧化系统(Kura2018)Nrf2转录因子调节200多个参与抗氧化和解毒的细胞保护蛋白的产生(Ma,2013)。在一项较早研究中,氢气DSS诱导的结肠炎的保护作用依赖于诱导血红素氧合酶-1的表达(Shen2017),这是Nrf2的下游靶点。然而,氢气诱导Nrf2激活的确切机制仍不清楚(LeBaron2019)

 

有趣的是,结肠炎和类风湿关节炎之间存在很强的正相关关系(Attalla2019)。因此,磺胺吡啶是治疗这两种炎症条件标准药物(Attalla2019)氢气也被证明对这两种疾病都是有效的。在小型临床研究中,氢气治疗在类风湿性关节炎患者中显示了显著的治疗效果(Ishibashi20122014)。此外,糖尿病治疗药物阿卡波糖被建议用于治疗结肠炎,这种药物被证明能够增加肠道细菌的产氢气(Zhang2012)

 

肠道菌群紊乱是包括结肠炎在内的许多病理和疾病的重要因素(Shen2018)。虽然在研究中没有进行这方面分析,但一些研究表明,氢气水有利于调节和改善小鼠的微生物组(Higashimura2018;Xiao2018)、山羊(Wang2017)、仔猪(Zheng2018)和人类(Sha2018)。因此,氢气水可能改善了DSS诱导的结肠炎小鼠的微生物组稳态,这有助于我们在本研究中观察到的良好效果。

 

总之,本研究提供了额外证据,表明氢气水可能作为一种治疗结肠炎潜在药物如果明确对人类具有这样作用需要进一步临床研究。此外,研究氢气的确切分子机制及其对肠道微生物群的影响,将有助于进一步了解和发展这种安全、简单的治疗方法。

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